聚六亚甲基胍消毒液杀菌效果及奶牛场应用观察
聚六亚甲基胍消毒液杀菌效果及奶牛场应用观察
原创 2016-04-22 张 弦 张峥臻 上海市奶牛研究所
摘要
为了解聚六亚甲基胍的杀菌及奶牛场应用效果，采用琼脂杀菌试验选择奶牛场最低使用浓度，微量肉汤稀释法测定消毒液最低抑菌浓度（MIC），现场带畜消毒试验，奶牛粘膜刺激试验和消毒液抗生素残留检测试验。结果表明聚六亚甲基胍在实验室针对奶牛场所分离的大肠杆菌和葡萄球菌的最低抑菌剂量分别为0.125%和0.0625%，因而推荐奶牛场最低使用浓度为0.2%；带畜消毒时动物并无排斥行为；将推荐最低使用浓度的消毒液涂抹于奶牛鼻粘膜、阴道粘膜、乳房，并无过敏等异常反应发生；当聚六亚甲基胍浓度大于0.02%时，抗生素检测为阳性；当其浓度小于0.002%时，抗生素检测为阴性。

关键字
A
聚六亚甲基胍；杀菌效果；MIC；带畜消毒
聚六亚甲基胍（PHMG），为一类环保型高分子聚合物杀菌剂，其性能优越，具有高效、安全、稳定、无刺激性等特点。聚六亚甲基胍中的胍基溶于水后带正电荷，易吸附在带负电荷的微生物表面，并且能渗透到微生物体内，破坏微生物体的细胞结构和能量物质代谢，使细菌和病毒丧失了活性。同时，聚合物形成的薄膜将会堵塞微生物的呼吸通道，使微生物迅速窒息而死亡,从而起到杀菌的作用。基于这一作用机理，病原微生物不易产生耐药性，因此，聚六亚甲基胍在纺织、水产养殖、洗手液等行业应用较为广泛，但在畜禽养殖业方面的应用较少。为观察该消毒液杀菌效果和奶牛场应用效果，在实验室和奶牛场分别进行了试验观察。本试验所使用的聚六亚甲基胍溶液的含量为25%。
一、材料与方法
1
消毒剂和试验菌
本试验所用消毒液由上海特龙生物科技发展有限公司提供，聚六亚甲基胍的含量为25%。
本次试验所用菌种为从上海地区某奶牛场采集的大肠杆菌和葡萄球菌，经稀释液配制成试验菌悬液备用。
2
琼脂杀菌（抑菌试验）
用去离子灭菌水将消毒液稀释成不同的浓度（1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.063%、0.031%、0.016%）。取两块血平板用接种环挑取大肠杆菌和葡萄球菌分别作致密划线。将不同浓度的消毒液滴加10μl于琼脂表面，不同浓度的消毒液排布方式参考药敏试验不同的药敏纸片排布。置37℃培养24h后观察消毒液覆盖范围内细菌生长情况，完全无细菌生长的最低浓度推荐为最低使用浓度。
3
微量肉汤稀释法测定MIC试验
取一块96孔板，在每孔中加入含TTC的灭菌营养肉汤100μl。在A∕B∕C∕D∕E∕F六排的第一孔内加入有效浓度为5%的消毒液100μl，然后对消毒液进行二倍稀释。即第一孔中加入消毒液后用移液枪充分吹打（至少5次以上）使消毒液与肉汤充分混匀，然后吸取100μl 加入第二孔再吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，吸取100μl 弃去；此时前六排每孔消毒液有效成分稀释度从左至右依次1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560，1：5120，1：10240，1∶20480，1：40960，1：81920。在A∕B∕C三排中每孔加入5μl大肠杆菌悬液，在D∕E∕F三排中加入5μl葡萄球菌悬液。在G排前六孔加入5μl大肠杆菌悬液，后六孔加入5μl葡萄球菌悬液，作为阳性对照。H排不加肉汤以外其他任何物质，作为阴性对照。置37℃恒温培养箱培养18~24h后观察，若有细菌生长TTC会显示红色；若没有细菌生长TTC则不变色。前六排中未变红色的最后一孔所对应的浓度便为消毒液的MIC值。
4
奶牛场带畜消毒试验
随机选择奶牛场奶牛的一个区（每个区平均分为两块区域，两个区域之间牛只可以自由活动），选择其中一个区域，进行喷洒消毒（消毒液浓度为以上试验所得推荐最低使用浓度），消毒范围包括空气、卧床和栏杆。观察奶牛行为有无异常，是否愿意在这一区域内活动，有无排斥反应。
5
粘膜刺激试验
在奶牛场随机选择8头奶牛，保定后用棉签蘸取推荐使用浓度的消毒液，涂抹于奶牛鼻粘膜、阴道粘膜以及乳头表面，五分钟后观察奶牛有无过敏或其他异常反应。
6
消毒液抗生素残留检测
取6个ECLIPSE50（E50）抗生素检测试剂单孔，使用牛奶将消毒液稀释到0.2%、0.02%、0.002%、0.0002%的有效浓度，取50μl加入到检测孔中，剩下两孔分别做阴性对照（加入无抗奶）和阳性对照（10ppb青霉素样品）。密封后将检测孔放入65℃水浴锅中，培养2小时30分钟。反应结束后取出检测孔从侧面观测孔中颜色，记录结果。
判读标准：黄色到浅黄色包括绿色为阴性结果范围；蓝绿色到紫色为阳性结果范围。
结果
1
琼脂杀菌（抑菌试验）结果
消毒液在稀释到0.125%时，其覆盖范围内大肠杆菌完全不生长，在0.0625%范围内有少量生长，之后的稀释度生长良好。结果表明该消毒液对大肠杆菌的有效杀灭浓度应在0.125%以上。
消毒液在稀释到0.0625%时，其覆盖范围内葡萄球菌完全不生长，在之后的稀释度生长良好。结果表明该消毒液对葡萄球菌的有效杀灭浓度应在0.0625%以上。
综合该消毒液对大肠杆菌和葡萄球菌的有效杀灭浓度，推荐实际使用的最低浓度为0.2%。
2
MIC试验结果
试验结果显示，5%消毒液在稀释到第10孔时，指示剂TTC变红，大肠杆菌及葡萄球菌开始大量生长，这表明消毒液在稀释到第9孔以后即0.01%以下时，消毒液杀菌效果不佳。即消毒液对大肠杆菌和葡萄球菌的最低抑菌浓度低于0.1gL。
3
奶牛场带畜消毒实验结果
奶牛表现正常，对消毒区域并无明显排斥行为。表明该消毒液可进行带畜消毒，消毒不会影响奶牛正常活动。
4
奶牛粘膜刺激试验结果
8头奶牛粘膜在涂抹0.2%聚六亚甲基胍消毒液后并无明显、红肿、发痒等过敏症状，奶牛表现正常。表明该消毒液对奶牛粘膜的刺激指数为0，属于无刺激性，因而可在奶牛场内放心使用。
5
消毒液抗生素残留检测结果
结果表明消毒液有效浓度在0.02%以上时抗生素检测为阳性；当有效浓度低于0.002%时抗生素检测为阴性。在奶牛场实际生产中，若是乳头上携带有消毒液，经挤奶前清洗、药浴和擦干后，其残留量一般为使用剂量的11000~110000，所以，0.2%的聚六亚甲基胍即使接触到了奶牛乳房，也并不会造成牛奶中抗生素的残留。
结语
结果表明，聚六亚甲基胍消毒液在奶牛场中理想的使用浓度为0.2%，此浓度对奶牛场中的常见菌均有较好的抑制杀灭效果。奶牛对该浓度的消毒液无明显排斥行为，消毒液对奶牛皮肤和粘膜也无明显刺激性。因此该消毒液安全可靠，可用于奶牛场带畜时的环境消毒。
（作者：张弦，张峥臻，张瑞华，张克