农业环境科学学报 2009,28(3):597-601 Journal of Agro-Environment Science

聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾不同生长阶段及 饵料藻类的安全性研究

王 群，刘 淇，李 峰，李 健

（中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071）

摘 要：采用药浴方式，研究了一种新型消毒剂—聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾受精卵、无节幼体、幼虾、成虾的毒性及饵料藻类的影响。结果表明，聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾幼虾 24、48 h 的LC50  为 64.1 mg·L-1  和 31.13 mg·L-1，安全浓度 Sc 为 2.20 mg·L-1；聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾成虾 24、48 h 的LC50  为 66.17 mg·L-1  和 32.16 mg·L-1，安全浓度 Sc 为 2.28 mg·L-1，为了保证凡纳滨对虾的安全性，聚六亚甲基双胍的用量应控制在 0.5 mg·L-1  之内；聚六亚甲基双胍在 125 mg·L-1  浓度内对受精卵的孵化率无明显影响，0.5 mg·L-1  浓度以内对无节幼体的变态率无明显影响。聚六亚甲基双胍对球等鞭金藻和亚心形扁藻表现出了明显的剂量-效应关系，其对球等鞭金藻和亚心形扁藻的生长不产生抑制的最高浓度为 5 mg·L-1；聚六亚甲基双胍对球等鞭金藻 48、96、144 h 的 EC50  为 27.01、34.95 mg·L-1  和 33.14 mg·L-1；亚心形扁藻为 34.65、28.73 mg·L-1  和 20.57 mg·L-1，聚六亚甲基双胍对两种藻类的安全浓度分别 3.5 mg·L-1  和 2.9 mg·L-1，表明聚六亚甲基双胍对亚心形扁藻的影响更明显。

关键词：凡纳滨对虾；聚六亚甲基双胍；饵料藻类；安全性

中图分类号：X592 文献标志码：A 文章编号：1672- 2043(2009)03- 0597- 05

Security on Different Growth Stages of Litopenaeus vannamei and Feeding Algae of Polyhexamethylene Biguanide（PHMB）

WANG Qun, LIU Qi, LI Feng, LI Jian

（Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China） Abstract：The security of polyhexamethylene biguanide（PHMB）on different growth stages of Litopenaeus vannamei and feeding algae were in－ vestigated. The results showed：cumulative mortality of juvenile and adult Litopenaeus vannamei increased with increasing concentration of PHMB. 24 h and 48 h median lethal concentrations（LC50）of PHMB on juvenile shrimp of  Litopenaeus vannamei were 64.1  mg·L-1  and

31.13 mg·L-1, and security concentration（Sc）was 2.20 mg·L-1. 24 h and 48 h median lethal concentrations（LC50）of PHMB on adult shrimp of Litopenaeus vannamei were 66.17 mg·L-1  and 32.16 mg·L-1, and security concentration（Sc）was 2.28 mg·L-1. In order to guarantee security on culturing Litopenaeus vannamei, the using amount of PHMB should below 0.5 mg·L-1. Hatching and metamorphosis test showed：hatching rate of control group was 87%, and hatching rate of test group was the range of 79%~92%. There was no significant influence on hatching rate of zygote when the concentration of PHMB below 125 mg·L-1, and there was no significant influence on metamorphosis rate of nauplius when the concentration of PHMB below 0.5 mg·L-1. With the increase of PHMB concentration, the growth inhibition rate of Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis was increasingly apparent. There was an excellent relationship between dose and effect of PHMB on Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis, and the sensitivity of Platymonas subcordiformis to PHMB is higher than Isochrysis galbana. The highest concentration of no significant influence of PHMB on Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis was 5 mg·L-1. 48 h, 96 h and 144 h EC50  of PHMB on Isochrysis galbana were 27.01, 34.95 mg·L-1  and 33.14 mg·L-1, and the corresponding concentrations of Platymonas

subcordiformis were 34.65，28.73 mg·L-1  and 20.57 mg·L-1. According to the classification of aquatic organisms toxicity, the toxicity of PHMB to Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis belonged to moderate toxicity.

Keywords：Litopenaeus vannamei; polyhexamethylene biguanide（PHMB）; feeding algae; security

收稿日期：2008-05-07

基金项目：国家科技支撑计划“工程化养殖高效生产体系构建技术研究与开发”（2006BAD09A03）；公益性行业科研专项“对虾养殖管理信息系统研究与建立”（nyhyzx07-042）

作者简介：王  群（1973—），女，山东蓬莱人，博士，副研究员，从事水产药理学研究。E-mail：wangqun@ysfri.ac.cn

通讯作者：李  健  E-mail：lijian@ysfri.ac.cn

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王 群等：聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾不同生长阶段及饵料藻类的安全性研究

2009 年 3 月

近年来，含氯消毒剂在防治对虾细菌性疾病方面发挥了巨大的作用[1-3]。但这些含氯消毒剂存在溶解性差、刺激性强和安全性不好等副作用，使用时其使用效果往往受水体中酸碱度和有机物的影响，聚六亚甲基双胍（polyhexamethylene biguanide，PHMB）属于阳离子表面活性剂，无色无味、易溶于水、性质稳定，杀菌过程中不发生强氧化反应，通过细胞内产生沉淀作用及细胞内磷的数量上升，阻碍细胞壁与核酸的合成[4-5]，由于其独特的结构和性能，在食品行业、环境消毒等方面得到了应用[6-7]；近年来，在水产养殖行业也得到一定程度的应用[8-9]。

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）又名南美白对虾，具有生长快、抗病力强等优点，1988   年从美国夏威夷引进我国，1992   年人工繁殖获得成功，目前占我国对虾养殖产量的 70%左右。本文采用药浴方式研究聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾受精卵、无节幼体、幼虾、成虾的安全性及饵料藻类的影响，评价聚六亚甲基双胍对对虾的毒性效应及生态毒理学效应，为药物合理安全使用提供必要的参考数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

聚六亚甲基双胍（含量 20%），试验中的数据已换算为纯的聚六 亚甲基双胍表示。

球等鞭金藻、亚心形扁藻由中国水产科学研究院黄海水产研究所提供。

凡纳滨对虾及其受精卵、无节幼体由青岛卓越水产养殖股份公司提供。

凡纳滨对虾幼虾和成虾购自青岛南山市场。

1.2 聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾幼虾和成虾的急性毒性试验

采用半静水法药浴方式，24 h 更换 100％试液，试

1.3 聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾受精卵和无节幼体毒性试验

1.3.1 凡纳滨对虾受精卵孵化率的影响试验

将受精卵放入配制好的不同浓度聚六亚甲基双胍溶液中浸泡一定时间后，用 100 目筛绢滤掉消毒剂溶液，然后用干净的海水充分冲洗去除残留在受精卵表面的消毒剂；再放入盛有 300 mL 孵化水的烧杯中孵化，每个烧杯放入 30 粒受精卵，每组 90 粒。试验水温 27~28 ℃，pH 8.0，盐度 31。试验过程中不充气，不换水，24 h 后对孵化出的无节幼体进行计数。采用 χ2检验比较试验组和对照组受精卵孵化率的显著性差异。

1.3.2 凡纳滨对虾无节幼体变态率的影响试验

试验在 500 mL 玻璃烧杯中进行，将凡纳滨对虾无节幼体分别放入盛有已配制好的 400 mL 不同浓度聚六亚甲基双胍溶液的烧杯中，观察记录 40 h 各组无节幼体变为蚤状幼体的情况。每个烧杯中放入 50 尾无节幼体，每组 150 尾。试验水温 28~30 ℃，pH8.0，盐度 31。试验过程中不充气，不换水。

1.4 聚六亚甲基双胍对饵料藻类的影响试验

根据预试验结果设计正式试验中聚六亚甲基双胍的浓度，试验浓度梯度按等对数间距设置；试验设空白对照组，每组设 3 个平行重复。将处于指数生长期的藻种用藻类培养液调整为适宜浓度，分装在 250 mL 经干热灭菌的锥形瓶中（200 mL·瓶-1），初始浓度为（3.08±0.14）×104  个·mL-1；然后加入聚六亚甲基双胍系列标准液，使藻液中的聚六亚甲基双胍的浓度为0、5、10、20、40、80、160 mg·L-1，每个浓度设 3 个平行重复，混匀后自然光 24 h 恒温（20±1）℃培养，每日振荡 3~4 次。每间隔 48 h 用显微镜观察藻细胞状态，并按帕森斯等[10]的方法采集样本，在血球计数板上计 数，取算数平均值。

用生长面积法[11]计算 96 h EC50：

验均设平行重复。凡纳滨对虾幼虾体长 4.6~5.5 cm，

IA=（AC-A）t

/AC×100%

成虾体长 11.3 ~12.7 cm，海水 pH8.0，盐度 31，水温

25.1~26.2 ℃，动物数量 30 尾·组-1，设平行重复；试验过程中不充气。

试验中观察记录 24、48 h 死亡数。毒性试验结果用半数致死浓度（LC50）和安全浓度（Sc）表示；半数致死浓度（LC50）采用移动平均角法计算；安全浓度（Sc）采用下式计算：

A=（N1-N0）/2×t1+（N1  +N2-2N0）2×（t2-t1）+…+（Nn-1

+N -2N）/2×（t -t  ）

式中：IA  为生长抑制百分率；AC  为空白组生长曲线以下面积；At  为受试浓度生长曲线以下面积：A 为生长曲线下面积；Nn  为 tn  时刻细胞密度；tn  为试验开始后第 n 次计数时间。

以 IA  为纵坐标和浓度对数为横坐标作图，IA =

Sc=（24

48 hLC50×0.3

50/48 hLC50）2

50%所对应的浓度即为 EC50。

安全浓度（CS）：CS  = 96 h EC

50×0.1

第 28 卷第 3 期 农 业 环 境 科 学 学 报

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2 试验结果

2.1 聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾的急性毒性

聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾幼虾和成虾 24、48 h 的死亡率见表 1~表 2。凡纳滨对虾幼虾和成虾的死亡率随聚六亚甲基双胍暴露浓度的增加而增加，随暴露时间的延长而增加。

2.2 聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾受精卵和无节幼体毒性

聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾受精卵孵化率和无节幼体变态率的影响如表 3 和表 4。对照组的孵化率为 87%，试验组的孵化率为 79%~92%，与对照组对虾受精卵孵化率差异不显著（P>0.05），表明聚六亚甲基双胍 125 mg·L-1  浓度以内处理凡纳滨对虾受精卵 10~30 min 对其孵化率无明显影响。当聚六亚甲基双胍的浓度为 1.0 mg·L-1，凡纳滨对虾幼体的变态率为 81%，与对照组之间差异显著（P<0.05）；当聚六亚甲

基双胍的浓度为 0.5 mg L-1

不同浓度聚六亚甲基双胍对球等鞭金藻的生长抑制试验结果见表 5。随着聚六亚甲基双胍质量浓度的升高，球等鞭金藻的生长受抑制愈加明显，当聚六亚甲基双胍的质量浓度为 80 mg·L-1  时，球等鞭金藻的生长完全受到抑制并最终导致其死亡，抑制率为100%。低质量浓度组（5 mg·L-1）的细胞生长不受抑制，48 h 的高质量浓度组（40 mg·L-1）的抑制率比低质量浓度组（10 mg·L-1）抑制率增加了 2 倍左右，96 h 和 144 h 的高质量浓度组（40 mg·L-1）的抑制率比低质量浓度组（10 mg·L-1）增加了 3 倍左右。低质量浓度组

（5、10、20 mg·L-1）随着暴露时间的延长，细胞生长受抑制不明显；高质量浓度组（40 mg·L-1）随着暴露时间的延长，细胞生长受抑制越明显，其 48、96、144 h 细胞的生长抑制率分别为 57.0%、81.8%、94.4%。聚六亚

表 4 聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾无节幼体变态率的影响

Table 4 Effect of PHMB on metamorphosis rate of nauplius

药物浓度/mg·L-1

concentration 0 0.125  0.25    0.5 1.0 2.0 4.0 8.0

态率为 95%，与对照组之间差异不显著（P>0.05）。

变 态 率 /% metamorphosis rate

100    100    100 95 81** 0** 0** 0**

2.3 聚六亚甲基双胍对饵料藻类影响试验

2.3.1 聚六亚甲基双胍对球等鞭金藻生长抑制试验

注：每个试验组与空白对照组进行显著性检验，表中变态率右上角的“**”表示 χ2 检验差异极显著（P<0.01）。

表 1 聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾幼虾的急性毒性试验结果

Table 1 Toxicity of PHMB on juvenile shrimp of Penaeus vannamei

注：24 h LC50：64.1 mg·L-1，95%置信范围为 48.09~83.02 mg·L-1；48 h LC50：31.13 mg·L-1，95%置信范围为 25.12~38.37 mg·L-1；Sc（安全浓度）：2.20 mg·L-1。

表 2 聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾成虾的急性毒性试验结果

Table 2 Toxicity of PHMB on adult shrimp of Penaeus vannamei

注：24 h LC50：66.17 mg·L-1，95%置信范围为 48.99~86.69 mg·L-1；48 h LC50：32.16 mg·L-1，95%置信范围为 26.13~39.43 mg·L-1；Sc （安全浓度）：

2.28 mg·L-1。

表 3 聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾受精卵孵化率的影响

Table 3 Effect of PHMB on hatching rate of zygote